Za vším hledej bílkovinu

Bílkoviny neboli proteiny, to není jen svalovina nebo vaječný bílek, ale především enzymy, které řídí všechny procesy v buňce - tedy v celém organismu.

Mechanismus působení proteinů spočívá v tom, že specificky reagují s různými buněčnými strukturami, a tak je ovlivňují. Molekuly proteinů jsou složené z aminokyselin, které se k sobě váží peptidickou vazbou. Slabé vazebné interakce, které se pak vytvářejí mezi různými funkčními skupinami aminokyselin, tvarují protein do různých specifických struktur.

A právě studiu změn struktur proteinů je v poslední době věnována nemalá pozornost. Vlivem fyzikálních nebo chemických faktorů dochází ke změnám ve vyšších strukturách proteinu. To může vést ke změněné funkci nebo až úplné ztrátě funkčnosti takového proteinu. Proto je nutné vytvářet postupy a kombinace postupů pro separaci proteinů z biologické matrice a metody, které jsou schopné tyto změny na vyšších strukturních úrovních odhalit. Tím se zabývají také na Mendelově zemědělské a lesnické univerzitě v Brně.

Jako modelový protein byl vybrán laktoferin, jenž je obsažen zejména v mléce. Laktoferin, který je také nazýván laktotransferin, byl objeven v roce 1939 v kravském mléku. Jeho jméno je odvozeno podle dřívější klasifikace jako nejvýznamnější bílkovina v mléce, která váže železo. V roce 1960 byl poprvé izolován z lidského mateřského mléka. V minulosti byl považován pouze za bakteriostatický železo-transportní protein v mléku. Plazmatický laktoferin je pravděpodobně syntetizován leukocyty. Nejvyšší hladina je pozorována v kolostru (až 7 g/l) a mléce (v průběhu laktace se sníží koncentrace oproti kolostru přibližně 7×), nižší hodnoty jsou v slzách, nosních tekutinách a slinách. Strukturně a chemicky je laktoferin glykoprotein složený z 703 aminokyselinových zbytků o molekulové hmotnosti kolem 77 000 Da.

Mezi doposud známé biologické funkce laktoferinu patří regulace homeostázy železa. Regulace homeostázy železa se odehrává převážně v tenkém střevě, kde je přijímáno z potravy. Zajímavý je vztah k regulaci buněčného růstu, diferenciaci buněk a protizánětlivé aktivitě. Z toho také vyplývá možný vztah ke zhoubným nádorům a procesu metastazování.

Cílem naší práce bylo rozlišení strukturních změn laktoferinu za využití elektrochemických technik. Toto se podařilo realizovat pomocí separace laktoferinu z mléka pomocí iontově výměnné monolitické kolony. Separace musela probíhat velice šetrně aby při ní nebyla narušena struktura samotného proteinu. Frakce která obsahovala separovaný laktoferin byla na konec podrobena analýze pomocí průtokové injekční analýzy s elektrochemickou detekcí.

Principem elektrochemické detekce pro stanovení proteinu je elektrochemická aktivita funkčních skupin aminokyselin v peptidovém řetězci proteinu například -SH nebo -NH2 skupiny. Sekvence aminokyselin v proteinu je daná a určuje tak primární strukturu proteinu. Vyšší struktury tedy sekundární, terciární a kvartérní jsou značně složitější a jsou stabilizovány celou řadou chemických a fyzikálních interakcí. V případě porušení těchto interakcí má za následek rozvolnění kompaktní "kostry" proteinu. Díky tomu dochází ke zpřístupnění funkčních elektrochemicky aktivních skupin, které jsme schopni detegovat a na základě jejich kvantifikace určit jak moc je daný protein strukturně pozměněn.

Až doposud mluvil Ondřej Zítka o studiu strukturních změn mléčného proteinu laktoferinu. Na Mendelově zemědělské a lesnické univerzitě v Brně se ale zabývají i jinými proteiny. Například tumorsupresorovým proteinem p53.

Více se dozvíte v přírodovědném magazínu Natura.