Jak se čte genom?
Slovo sekvenování je pro nás dnes celkem běžné. Chápeme ho jako přečtení nebo rozluštění genomu. Jak se ale takový genom prakticky opravdu čte? Je to opravdu tak jednoduché?
Možná si vzpomínáte, že 23. dubna byla v Ústavu experimentální botaniky AV ČR v Olomouci otevřena nová Laboratoř pro genomiku rostlin. Její hlavní pracovní náplní bude sekvenování genomu pšenice. Je jen shodou náhod, že tento projekt, kde hraje důležitou roli český výzkum a čeští vědci, se objevil přesně čtyři roky po tom, co bylo dokončeno sekvenování lidského genomu.
Slovo sekvenování je tedy poměrně dobře známé a představujeme si pod ním něco jako přečtení nebo rozluštění genomu. Jak se ale takový genom čte?
Sekvenování
Genom, tedy veškerou genetickou inrofmaci jednotlivce, není možné v současnosti analyzovat vcelku (v případě lidského genomu by šlo o 3 miliardy párů bazí), ale musí být nejdříve nastříhána na kratší úseky (700 - 800 párů bazí) pomocí enzymů. Takto připravené krátké úseky DNA se potom analyzují na sekvenátoru. S tak jednoduchým vysvětlením velmi složitého procesu se ale nesmíříme.
Maxam-Gilbertova metoda sekvenování (chemická metoda)
Podstatou chemické metody sekvenování je specifické štěpení molekuly DNA chemickými činidly v místech baze určitého typu. Úsek genomu, který chceme sekvenovat, se rozdělí do čtyř zkumavek, kde jsou přítomna činidla, která jsou schopna chemicky modifikovat vždy jeden druh báze. Jiné chemické látky pak v pozměněných místech řetězec DNA rozštěpí.
Směs různě dlouhých kousků DNA se rozdělí pomocí gelové elektroforézy. Delší úseky DNA se na gelu v elektrickém poli pohybují pomaleji než ty krátké. Po obarvení gelu tak získáme systém proužků, ze kterých lze vzájemným porovnáváním a kombinováním odvodit původní pořadí nukleotidů v sekvenci.
Sangerova metoda sekvenování (enzymatická metoda)
Na podobném principu pracuje také enzymatická metoda. Stejně jako u chemické metody, i zde dochází ke štěpení DNA v místech s konkrétním typem báze, a to tak, že se při polymerázové řetězové reakci náhodně začleňují do DNA dideoxynukleotidy, které reakci přeruší. I když je toto vysvětlení možná trošku složité, výsledek je stejný jako u chemické metody. Na konci reakce máme směs různě dlouhých úseků DNA, kterou pak vyhodnocujeme pomocí gelové elektroforézy.
Nové přístupy v sekvenování
Sekvenování genomu člověka trvalo od roku 1990 do roku 2003 - tedy 13 let, pracovalo na něm 20 laboratoří z celého světa a stálo tolik co cesta na Měsíc. To je ale pro lékařské účely příliš zdlouhavé a nákladné. Budoucnost proto vyžaduje nové přístupy k sekvenování.
Technika nanopórového sekvenování
Jednou z možností je technika nanopórového sekvenování. Jednovláknový řetězec DNA prochází pórem o velikosti 1,5 nm. Při průchodu jednotlivé báze vyvolávají změny v elektrické vodivosti póru. A protože každá báze vytváří změnu jinou, jsme schopni takto velmi elegantně, dalo by se říci "online", zjistit sekvenci DNA řetězce bez jakéhokoliv štěpení.
Elektrochemický přístup
V šedesátých letech minulého století zjistil prof. Emil Paleček, že se nukleové báze se dají stanovit pomocí elektrochemických metod. Tehdy bylo ovšem možné dobře rozlišit pouze dva signály, a to guaninu (G signál) a adeninu + cytosinu dohromady (AC signál). O dalších dvacet let později se zrodila myšlenka rozdělit signál AC pomocí speciální matematické korekce, kterou navrhl prof. Oldřich Dračka a kterou spolu s doc. Libuší Trnkovou realizoval. Všechny tyto experimenty byly prováděny na povrchu rtuťové elektrody.
Potřeba miniaturizovat elektrochemické analyzátory přinesla rozvoj dalších druhů elektrod, především uhlíkových. A právě pomocí těchto elektrod byly pozorovány signály všech čtyř bazí při jiném potenciálu, což bylo publikováno skupinou prof. Anny Marii Oliveiry Brett z Portugalska a posléze také Laboratoří biochemie a bioelektrochemie Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně. Tento objev otevírá nové možnosti při elektroanalýze nukleových kyselin.
Genom za 1000 dolarů?
Snad právě tyto metody povedou k řešení projektu americké vlády - "Osobní genom", jehož cílem je přečtení lidského geonomu za 100 000 dolarů do roku 2009 a za 1000 dolarů do roku 2014.
A současnost?
V současnosti je možné sekvenovat 1400 párů bází za dolar. Když si uvědomíme, že lidský genom má 3 miliardy bází a je potřeba sekvenovat oba řetězce dvoušroubovice (protože mutace může být na každém z nich), dostáváme s k číslu 6 miliard bází, což po přepočítání na dolary znamená přes 4 miliony. To je zatím cena poměrně vysoká, nicméně stále pokračuje proces automatizace a miniaturizace a už dnes se snížila spotřeba činidel asi miliardkrát.
Více se dozvíte v přírodovědném magazínu Natura.